Vækst-og næringsstof dynamik Ochromonas sp., stamme BG-1
Phagotrophy af phototrophic flagellates menes at indebære betydelige miljømæssige fordele, alger, der udviser den adfærd (Flynn og Mitra, 2009), men der synes også at være begrænsninger (selv om stort set uncharacterized) for at gennemføre blandet ernæring på samme tid i en enkelt celle (Ravn, 1997). Disse begrænsninger kan indebære omkostninger eller afvejninger for at opretholde dobbelt cellulære machineries (sammenlignet med specialiserede konkurrenter), eller måske cross-talk mellem anabolske og kataboliske biokemiske veje, der forvirrer udførelsen af begge aktiviteter samtidigt., Desværre er der stort set ingen kvantitative oplysninger om omkostninger og fordele ved mixotrophic adfærd, eller om begge processer udføres sekventielt eller samtidigt med disse arter. Temporal partitionering kan være en mekanisme til at opretholde begge evner i små celler (omend at sætte en proces ‘på hold’ til enhver tid)., Vurderingen af, om både adfærd forekommer samtidigt, kan de specifikke fysiologiske fordel(s) for heterotrofe ernæring i mixotrophic alger, og reaktionsevne denne adfærd til abiotiske og biotiske variabler er aspekter af mixotrophic ernæring, der har været vanskeligt at etablere traditionelle tilgange og metoder.
Vi studerede den mi .otrophic chrysophyte Ochromonas sp., stamme BG-1, fordi det kan være dyrket i axenic kultur (bakterier-fri), og det er tidligere blevet rapporteret, at en overvejende heterotrofe organismer som opnår høje vækstrater kun i tilstedeværelse af bakterier (Sanders et al., 2001). Vækst i axenic kultur forhindret potentielt komplicerede biologiske interaktioner og elementære strømme, der hidrører fra aktiviteter i andre levende mikroorganismer, i de kulturer, hvorved en sammenligning mellem nanoSIMS og bulk IRMS målinger og en bedre forståelse af de specifikke kilder af kulstof og kvælstof, der anvendes til vækst af alge.,
derudover forenklede brugen af en enkelt uorganisk nitrogenkilde vores eksperimentelle design, så de eneste kilder til nitrogen i mediet var ammonium eller HKB. Alger har generelt mekanismer til optagelse og assimilering af både ammonium og nitrat, men transkriptomiske data indikerer, at nogle chrysophytes, herunder Ochromonas sp. stamme BG-1, mangler muligvis den genetiske evne til nitratassimilering (Terrado et al., 2015; Lie et al., 2017)., Desuden blev mes-buffer ikke tilsat til mediet i vores forsøg, fordi dette kunne have givet en alternativ nitrogenkilde. MES kunne også have udgjort en kilde til organisk kulstof til algen (Sanders et al ., 2001), og dens eliminering sikrede, at de eneste kilder til kulstof i mediet enten var bicarbonat eller HKB. Transkriptomisk analyse fra eksperimenter udført på samme måde som dem, der præsenteres i dette manuskript, viser, at fotosyntetiske maskiner af Ochromonas sp. stamme BG-1 udtrykkes og opreguleres i nærvær af lys (Lie et al., 2017)., Denne forenklede tilgang kombineret med stabil isotopmærkning gjorde det muligt for os at bestemme, hvilken kilde(er) nitrogen og kulstof der blev brugt til vækst af algen.
signifikante vækstrater for Ochromonas i den foreliggende undersøgelse blev kun opnået, mens HKB var rigelige som Bytte (figur 1a). Chl a-dynamikken i kulturen afspejlede også de høje vækstrater på grund af græsning på HKB, da koncentrationen af Chl a−celle-1 faldt med en størrelsesorden i løbet af de første 48 timer af inkubation for kulturer dyrket i lyset såvel som i kontinuerligt mørke (figur 1d)., Disse ændringer i cellulær klorofyl kan være relateret til en fortynding af Chl a inde i cellerne på grund af algens høje vækstrater (Hansen et al., 2000), således at reduktionen af Chl a−celle-1 var en konsekvens af hurtigt voksende algerhastigheder og ikke en direkte reduktion af klorofylbiosyntesehastighed. Det er dog også muligt, at der var en vis regulering af klorofyl biosyntese, når HKB var til stede som transcriptomic analyse på denne alge foreslår opregulering af gener relateret til klorofyl syntese i tilstedeværelse af lys, når HKB var forarmet (Lie et al., 2017)., Under alle omstændigheder er disse observationer i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af Ochromonas (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001), som har observeret en veludviklet heterotrofe kapacitet, hvilket tyder på, at kulstofbindingen og måske andre cellulære strukturer og processer, der er involveret i fotosyntesen er reduceret, når voksende mixotrophically, som er observeret for nogle andre alger (Wan et al., 2011).
opløst ammonium såvel som phosphat akkumuleret i Ochromonas-kulturerne i løbet af de første 48 timer af eksperimenterne, da HKB blev aktivt græsset (figur 2)., Dette resultat indikerer, at overskydende nitrogen og fosfor fra græsset HKB blev udskilt af algen. Massebalanceberegninger baseret på ændringer i byttedyr / algeforekomster og deres cellulære nitrogenindhold indikerede, at op til 50% af nitrogen indeholdt i forbrugt HKB blev assimileret af algen, mens en betydelig mængde af det overskydende nitrogen primært blev frigivet som ammonium i perioden med aktiv bakteriel græsning (figur 2)., Disse værdier for kvælstof-assimilation (og udskillelse), er i overensstemmelse med assimilation effektivitet af heterotrofe protists af lignende størrelse (Taylor, 1982; Caron og Goldman, 1990), er i overensstemmelse med den konklusion, at Ochromonas var voksende overvejende som en heterotroph når byttet var rigeligt. Desuden har transkriptomiske analyser vist, at forskellige ammoniumtransportører er udtrykt ved Ochromonas sp. stamme BG-1 vokser på HKB sammenlignet med vækst, efter at bakterier er blevet græsset til meget lave mængder (Lie et al., 2017)., Det ser derfor ud til, at transportvirksomhederne med henblik på eksport af ammonium ud af cellen kan være anderledes end dem, der anvendes for ammonium-optagelse, som har været observeret for andre organismer (Shnaiderman et al., 2013).
interessant nok faldt koncentrationerne af ammonium, men ikke fosfat, i mediet, når HKB var blevet fjernet ved græsning (det vil sige efter 48 timer; figur 2), når Ochromonas blev dyrket i lyset., Dette resultat synes at indikere, at algen aktivt optog ammonium (men ikke fosfat) fra mediet, når bakterier ikke længere var tilgængelige og fotosyntese blev induceret (figur 1d). I modsætning hertil fortsatte både ammonium og fosfat i de kulturer, der blev dyrket i mørket, med at stige gennem hele eksperimentet (stiplede linjer i figur 2). Ingen signifikant nettoalger befolkningstilvækst forekom efter udtømning af bytte selv i lyset, og forklaringen på dikotomien i optagelsen af disse to elementer er uklar., Vi spekulerer i, at ammonium blev taget op, fordi det specifikt var nødvendigt for at genopbygge cellens fotosyntetiske maskiner.
Den fortsatte udseende af fosfat i dyrkningsmedium i løbet af den senere del af de eksperimenter, som står i kontrast til undersøgelser af nogle andre Ochromonas arter, der har rapporteret en optagelse af fosfat, når alge der vokser autotrophically (Rothhaupt, 1996)., Den manglende optagelse af fosfat stamme BG-1 kunne tyde på, at denne Ochromonas var ude af stand til effektivt fosfat-optagelse (hvilket måske også kan forklare, i del, de fattige phototrophic vækst kapacitet af denne stamme), eller at fosfor var ikke behov for betydelige beløb, for cellulær reorganisering, der er forbundet med den ændring at phototrophic vækst, og derfor optagelsen blev ikke stimuleret af den ændring, at phototrophy., Det er usandsynligt, at de fortsatte stigninger i koncentrationen af fosfat skyldtes nedbrydning af opløste organiske fosforforbindelser i mediet, fordi kulturerne ikke havde levende bakterier.
Slutninger fra haber eksperimenter
af Stabile isotoper (nanoSIMS og bulk elementar analyse-IRMS) viste, at både uorganiske (13C-bikarbonat og 15N-ammonium) substrater og 13C/15N-mærket HKB blev assimileret af Ochromonas, der bidrager til 15N og 13C cellulære berigelse efter 48 h inkubation (Figur 4)., Imidlertid, størrelsen af berigelse fra uorganiske substrater eller HKB indikerede, at, under mi .otrofisk vækst, de primære kilder til kulstof og nitrogen blev afledt af fagotrofi. Isotopisk massebalance indikerede, at 88-95% af nitrogenet og 84-99% af carbon stammede fra HKB, når Ochromonas voksede mi .otrophically i lyset. En berigelse på 13C blev observeret i alger dyrket i lyset sammenlignet med mørket (eksperiment 1 vs eksperiment 3), Når 13C-bicarbonat var tilgængeligt (figur 4)., Imidlertid var det beregnede bidrag fra fotosyntetisk carbonfiksering kun 1-10% af det kulstof, der blev assimileret til biomasse. Den større effektivitet af kvælstofindtagelse fra bytte observeret i lyset i forhold til kontinuerligt mørke (figur 3; eksperimenter 1, 2 vs eksperiment 3) antyder, at lys spillede en rolle, omend en mindre, i fagotrofisk effektivitet af algen., Derfor, på trods af formodede reduktion i den fotosyntetiske maskiner af Ochromonas voksende phagotrophically på HKB (som det fremgår af lav celle kvoter af Chl a; Figur 1d), lyset havde en mindre positiv effekt på alge-ernæring. Fordi mængden af kulstof fast ved fotosyntese udgjorde en lille brøkdel af kulstof, der optages af den alge, når de vokser på HKB, vi spekulere, at den fotosyntetiske apparater kan være at levere energi snarere end kul for cellulært materiale, som det har været en hypotese for Ochromonas danica (Wilken et al., 2014).,
vores isotopiske massebalanceberegninger har to advarsler. Først, vi kontrollerede ikke pH-udviklingen inden for kulturerne, hvilket ville have givet bedre indsigt i carbonatbalancen, der kunne have været påvirket af åndedræt og kulstoffiksering, og udveksling med atmosfæren. Som sådan kan vores estimat baseret på eksperimenterne ved anvendelse af mærket uorganisk kulstof have undervurderet mængden af uorganisk kulstof, der er fastgjort af Ochromonas sp. BG-1 (1% i henhold til den isotopiske massebalance)., Under alle omstændigheder burde eksperimentet med mærket HKB ikke have været påvirket af dette advarsel, og estimatet af 10% kulstof afledt af uorganisk substrat er sandsynligvis realistisk. For det andet betragtes Ochromonas som en ineffektiv carbonfi .er på grund af manglende kulstofkoncentrationsmekanismer (Maberly et al. 2009), der øger CO2-koncentrationen via transport af CO2 og / eller bicarbonat til RubisCO-en .ymet (Raven et al., 2008). På den anden side har transkriptomisk analyse vist, at det fotosyntetiske maskiner i stamme BG-1 er funktionelt (Lie et al.,, 2017), og vores eksperimenter ved hjælp af mærket bicarbonat viste en signifikant berigelse af 13C fraktioneret overflod i Ochromonas (figur 4 og 5); Derfor ochromonas sp. stamme BG-1 har en vis evne til at bruge uorganisk kulstof, omend ineffektivt.
ikke desto mindre vil den stærke heterotrofiske aktivitet af Ochromonas under dyrkning af Mi .otrophically sandsynligvis øge den intracellulære CO2-pulje såvel som dens Flu.. Som en tommelfingerregel anses det, at heterotrofe protister assimilerer 40% af det indtagne organiske stof, mens de frigiver 30% og respirerer yderligere 30% (Sleigh, 1989)., Baseret på dette kan den samlede mængde kulstof, der frigives af Ochromonas som CO2 under eksponentiel vækst, være så høj som det samlede bikarbonat tilsat i begyndelsen af inkubationen, hvilket har konsekvenser for den isotopiske massebalance, vi har præsenteret. Hvis vi antager, at den isotopisk berigede CO2 afledt af HKB-respirationen er tilgængelig på samme niveauer som det opløste uorganiske kulstof, viste inkubationen udført med Ochromonas og mærket HKB, at ~84% kulstof blev afledt af HKB., Op til 20% af det assimilerede kulstof afledt af HKB kunne faktisk svare til kulstof, der oprindeligt blev respireret og derefter fikseret af Ochromonas. Hvis korrekt, respiration afledt af fagotrofisk aktivitet ville fungere som en kulstof koncentration mekanisme slags for denne Ochromonas. Mens den primære kilde til kulstof til Ochromonas voksende mixotrophically stammer fra HKB, et ikke-ubetydeligt beløb, der kunne have været afledt af respiration og derefter CO2-fiksering af den bakterielle biomasse.,
Ochromonas skiftede sin metabolisme mod autotrofi, når den inkuberes i lyset, men først efter at den havde udtømt HKB i kulturerne (48 48 h vækst). Dette skift blev afspejlet i bulk IRMS 13C relativ overflod for behandling ved hjælp af mærket HKB, hvor en reduktion blev observeret mellem 48 timer og 145 h (forsøg 2 i Figur 5), hvilket viser inkorporering af den være uden navn kulstof i algebiomasse via lys processer. Chrysophytes betragtes generelt som dårlige autotrofe carbonfiersere på grund af dårlige kulstofkoncentrationsmekanismer (Maberly et al., 2009)., Ikke desto mindre indikerer disse resultater, at der var et signifikant niveau af uorganisk kulstofassimilering. En sammenligning af kulturer dyrket i lyset (Eksperiment 1 i Figur 5) og kontinuerlig mørke (forsøg 3 i Figur 5) viste, at 15N relativ overflod af mørke kulturer ikke ændre sig efter 95 h, mens kulturer i lyset fortsatte med at berige i 15N, hvilket indikerer, at Ochromonas fortsatte med at optage kvælstof for at opretholde stofskiftet, når HKB blev forarmet., Disse resultater var i overensstemmelse med observerede fald i koncentrationen af ammonium i mediet i denne periode (figur 3a), skønt det fortsatte udseende af phosphat i mediet i denne periode er uforklarligt.
Vi opnåede god samlet aftale mellem masseisotopmålinger og nanoSIMS målinger for nitrogen, i overensstemmelse med observationer i tidligere undersøgelser (Popa et al., 2007; Orphan and House, 2009; Kopf et al., 2015; figur 4c)., Imidlertid var bulkmålingerne noget lavere med hensyn til fraktionerede overflodsværdier for kulstof, især for stærkt berigede prøver (figur 4d). Vi spekulerer i, at forskellene mellem nanoSIMS og bulkisotopmålinger for kulstof kan relateres til det faktum, at nanoSIMS-prøver blev konserveret med glutaraldehyd, hvorimod prøverne til bulkanalyse ikke var. Fiksering har vist sig at påvirke cellulært kulstof(Musat et al ., 2014), selvom vi måske havde forventet, at dette ville fortynde 13C i nanoSIMS-målingerne i forhold til bulkværdierne., En mere sandsynlig forklaring er, at enkeltcellemålingerne ikke påvirkes af cellulært affald i kulturen, der kan være mindre beriget. Bulk – 13C-værdien kan fortyndes af disse komponenter i forhold til nanoSIMS-målingerne, hvilket indebærer, at nanoSIMS-dataene mere nøjagtigt afspejler kulstof-og nitrogenoptagelsen af algerne. Imidlertid kan celle til celle-variabilitet også have bidraget til de mindre forskelle mellem bulk-og nanoSIMS-målingerne.,
brugen af nanoSIMS i denne undersøgelse repræsenterer sin første anvendelse mod undersøgelsen af kulstof-og næringsstoffluxeser i en mi .otrofisk alge og har muliggjort en bedre forståelse af kulstof-og energiopkøb af denne art og cellulær metabolisme. Vores resultater udvider information tilgængelig fra traditionelle analyser af Ochromonas sp. stamme BG-1 dyrket under forskellige forhold med lys og byttetilgængelighed (Sanders et al., 2001), der bekræfter, at det meste af nitrogen og kulstof, der anvendes til vækst, opnås gennem dets bakterielle bytte., Selvom resultaterne ikke direkte kan ekstrapoleres til alle arter langs kontinuum af alger med forskellige mixotrophic strategier, vores arbejde validerer brug af haber-eksperimenter og nanoSIMS til bedre at forstå den metaboliske fundament for mixotrophy i én art. Desuden giver den en tilgang til vurdering af Mi .otrofisk ernæring i miljøprøver. Ochromonas sp. stamme BG-1 leverede et ideelt modelsystem til sammenligning af masseisotopanalyse med nanoSIMS, fordi bakterier hurtigt blev fjernet ved græsning inden for de første 48 timer af eksperimenterne., Aftalen mellem de to målinger viser, at nanoSIMS præcist tages højde for dynamikken af kulstof og næringsstoffer køb i denne mixotroph, og kunne derfor være mere bredt anvendt til at udforske mixotrophy i komplekse blandet samfund, hvor hovedparten forholdsregler ville være utilstrækkelige til at indfange disse dynamikker. Denne og fremtidige detaljerede undersøgelser vil fortsat give forbedringer i vores forståelse af ernæringen af Mi .otrofe alger.