Wachstums-und Nährstoffdynamik von Ochromonas sp.,- , Dehnungs-BG-1
Phagotrophy durch phototrophe Flagellaten ist geglaubt zu verleihen deutliche ökologische Vorteile auf Algen, die das Verhalten (Flynn und Mitra, 2009), aber auch erscheinen die Grenzen (obwohl weitgehend uncharacterized) für die Durchführung einer gemischten Ernährung gleichzeitig in einer einzigen Zelle (Raven, 1997). Diese Einschränkungen können Kosten oder Kompromisse für die Aufrechterhaltung dualer zellulärer Maschinen (im Vergleich zu spezialisierten Wettbewerbern) oder möglicherweise ein Cross-Talk zwischen anabolen und katabolen biochemischen Wegen mit sich bringen, die die Leistung beider Aktivitäten gleichzeitig beeinträchtigen., Leider gibt es praktisch keine quantitativen Informationen über die Kosten und Vorteile des mixotrophen Verhaltens, noch darüber, ob beide Prozesse sequentiell oder gleichzeitig von diesen Spezies durchgeführt werden. Die zeitliche Partitionierung könnte ein Mechanismus sein, um beide Fähigkeiten in winzigen Zellen aufrechtzuerhalten (wenn auch zu einem bestimmten Zeitpunkt ein Prozess „auf Eis gelegt“ wird)., Die Beurteilung, ob beide Verhaltensweisen gleichzeitig auftreten, der spezifische physiologische Nutzen(die spezifischen physiologischen Vorteile) für die heterotrophe Ernährung bei mixotrophen Algen und die Reaktionsfähigkeit dieses Verhaltens auf abiotische und biotische Variablen sind Aspekte der mixotrophen Ernährung, die mit traditionellen Ansätzen und Methoden schwer festzustellen waren.
Wir untersuchten den mixotrophen Chrysophyten Ochromonas sp., stamm BG-1, weil es in axenischer Kultur (bakterienfrei) angebaut werden kann und es wurde zuvor berichtet, dass es sich um einen überwiegend heterotrophen Organismus handelt, der nur in Gegenwart von Bakterien hohe Wachstumsraten erreicht (Sanders et al., 2001). Das Wachstum in der axenischen Kultur verhinderte, dass biologische Wechselwirkungen und Elementarströme, die sich aus den Aktivitäten anderer lebender Mikroorganismen in den Kulturen ergaben, möglicherweise erschwert wurden, wodurch ein Vergleich zwischen NanoSIMS-und Bulk-IRMS-Messungen und ein besseres Verständnis der spezifischen Kohlenstoff-und Stickstoffquellen ermöglicht wurden, die für das Wachstum der Alge verwendet werden.,
Zusätzlich vereinfachte die Verwendung einer einzigen anorganischen Stickstoffquelle unser Versuchsdesign, so dass die einzigen Stickstoffquellen im Medium Ammonium oder HKB waren. Algen besitzen im Allgemeinen Mechanismen für die Aufnahme und Assimilation von Ammonium und Nitrat, aber transkriptomische Daten zeigen, dass einige Chrysophyten, einschließlich Ochromonas sp. stamm BG-1, könnte die genetische Fähigkeit zur Nitratassimilation fehlen (Terrado et al., 2015; Lie et al., 2017)., Darüber hinaus wurde dem Medium in unseren Experimenten kein MES-Puffer zugesetzt, da dies möglicherweise eine alternative Stickstoffquelle bereitgestellt hat. MES könnte auch eine Quelle von organischem Kohlenstoff für die Alge gebildet haben (Sanders et al., 2001), und seine Eliminierung stellte sicher, dass die einzigen Kohlenstoffquellen im Medium entweder Bicarbonat oder HKB waren. Transkriptomische Analysen aus Experimenten, die auf die gleiche Weise durchgeführt wurden wie die in diesem Manuskript vorgestellten, zeigen, dass die photosynthetische Maschinerie von Ochromonas sp. der Stamm BG-1 wird in Gegenwart von Licht exprimiert und hochreguliert (Lie et al., 2017)., Dieser vereinfachte Ansatz in Kombination mit einer stabilen Isotopenmarkierung ermöglichte es uns zu bestimmen, welche Stickstoff-und Kohlenstoffquellen von der Alge für das Wachstum verwendet wurden.
Signifikante Wachstumsraten von Ochromonas in der vorliegenden Studie wurden nur erreicht, während HKB als Beute reichlich vorhanden waren (Abbildung 1a). Die Chl-a-Dynamik in der Kultur spiegelte auch die hohen Wachstumsraten aufgrund der Beweidung auf HKB wider, da die Konzentration von Chl−a-Zelle-1 während der ersten 48 h Inkubationszeit für im Licht sowie in kontinuierlicher Dunkelheit gewachsene Kulturen um eine Größenordnung abnahm (Abbildung 1d)., Diese Veränderungen im zellulären Chlorophyll könnten aufgrund der hohen Wachstumsraten der Alge mit einer Verdünnung von Chl a in den Zellen zusammenhängen (Hansen et al., 2000), so dass die Reduktion von Chl a cell−1 eine Folge von schnell wachsenden Raten der Alge und nicht einer direkten Reduktion der Chlorophyllbiosyntheserate war. Dennoch ist es auch möglich, dass es eine gewisse Regulation der Chlorophyllbiosynthese gab, wenn HKB vorhanden war, da die transkriptomische Analyse dieser Alge eine Hochregulation von Genen nahe legt, die mit der Chlorophyllsynthese in Gegenwart von Licht zusammenhängen, wenn HKB erschöpft war (Lie et al., 2017)., In jedem Fall stimmen diese Beobachtungen mit früheren Studien von Ochromonas überein (Pringsheim, 1952; Sanders et al., 2001), die eine gut entwickelte heterotrophe Fähigkeit beobachteten, was darauf hindeutet, dass Kohlenstofffixierung und möglicherweise andere zelluläre Strukturen und Prozesse, die an der Photosynthese beteiligt sind, reduziert werden, wenn sie heterotroph wachsen, wie bei einigen anderen Algen beobachtet (Wan et al., 2011).
Gelöstes Ammonium sowie Phosphat sammelten sich in den ersten 48 h der Versuche in den Ochromonas-Kulturen an, als HKB aktiv beweidet wurden (Abbildung 2)., Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass überschüssiger Stickstoff und Phosphor aus der beweideten HKB von der Alge ausgeschieden wurden. Massenbilanzberechnungen auf der Grundlage von Änderungen der Beute / Algen-Abundanzen und ihres zellulären Stickstoffgehalts zeigten, dass bis zu 50% des im HKB enthaltenen Stickstoffs von der Alge assimiliert wurden, während während der aktiven Bakterienweidezeit eine beträchtliche Menge des überschüssigen Stickstoffs hauptsächlich als Ammonium freigesetzt wurde (Abbildung 2)., Diese Werte für die Stickstoffassimilation (und-Ausscheidung) stimmen mit den Assimilationseffekten heterotropher Protisten ähnlicher Größe überein (Taylor, 1982; Caron und Goldman, 1990), im Einklang mit der Schlussfolgerung, dass Ochromonas vorwiegend als Heterotropie wuchs, wenn sie reichlich vorhanden waren. Des Weiteren haben transkriptomische Analysen gezeigt, dass verschiedene Ammoniumtransporter durch Ochromonas sp exprimiert werden. stamm BG-1 wächst auf HKB im Vergleich zum Wachstum, nachdem Bakterien in sehr geringen Mengen geweidet wurden (Lie et al., 2017)., Es scheint daher, dass Transporter für den Export von Ammonium aus der Zelle anders sein können als diejenigen, die für die Ammoniumaufnahme verwendet werden, wie dies für andere Organismen beobachtet wurde (Shnaiderman et al., 2013).
Interessanterweise nahmen die Konzentrationen von Ammonium, aber nicht Phosphat, im Medium ab, sobald die HKB durch Weiden (dh nach 48 h; Abbildung 2) entfernt worden war, als Ochromonas im Licht gezüchtet wurde., Dieses Ergebnis scheint darauf hinzudeuten, dass die Alge aktiv Ammonium (aber nicht Phosphat) aus dem Medium aufnahm, als Bakterien nicht mehr verfügbar waren und die Photosynthese induziert wurde (Abbildung 1d). Im Gegensatz dazu, sowohl ammonium und Phosphat in Kulturen angebaut, die in der Dunkelheit weiter steigen während des gesamten Experiments (gestrichelte Linien in Abbildung 2). Nach der Erschöpfung der Beute trat auch im Licht kein signifikantes Nettoalgenpopulationswachstum auf, und die Erklärung für die Dichotomie bei der Aufnahme dieser beiden Elemente ist unklar., Wir spekulieren, dass Ammonium aufgenommen wurde, weil es speziell für den Wiederaufbau der photosynthetischen Maschinerie der Zelle benötigt wurde.
Das anhaltende Auftreten von Phosphat im Kulturmedium während des späteren Teils der Experimente steht im Gegensatz zu Studien einiger anderer Ochromonas-Arten, die über eine Phosphataufnahme berichtet haben, wenn die Alge autotrophisch wächst (Rothhaupt, 1996)., Der Mangel an Phosphataufnahme durch Stamm BG-1 könnte darauf hindeuten, dass dieser Ochromonas nicht in der Lage war, eine effektive Phosphataufnahme zu erreichen (was teilweise auch die schlechte phototrophe Wachstumskapazität dieses Stammes erklären könnte), oder dass Phosphor nicht in signifikanten Mengen für die zelluläre Reorganisation benötigt wurde, die mit der Änderung des phototrophen Wachstums verbunden war, und daher wurde die Aufnahme nicht durch die Änderung der Phototrophie stimuliert., Es ist unwahrscheinlich, dass der anhaltende Anstieg der Phosphatkonzentration auf die Zersetzung gelöster organischer Phosphorverbindungen im Medium zurückzuführen ist, da die Kulturen keine lebenden Bakterien aufwiesen.
Schlussfolgerungen aus stabilen Isotopensondenexperimenten
Die stabile Isotopenanalyse (NanoSIMS und Bulk Elemental Analysis-IRMS) ergab, dass sowohl anorganische (13C-Bicarbonat und 15N-Ammonium) Substrate als auch 13C/15N-markierte HKB von Ochromonas assimiliert wurden, was nach 48 h Inkubation zur Anreicherung von 15N und 13C beitrug (Abbildung 4)., Die Größe der Anreicherung aus anorganischen Substraten oder HKB zeigte jedoch, dass während des phagotrophen Wachstums die primären Kohlenstoff-und Stickstoffquellen aus der Phagotrophie abgeleitet wurden. Der isotopische Massenbilanz zufolge stammten 88-95% des Stickstoffs und 84-99% des Kohlenstoffs aus HKB, als Ochromonas im Licht isotrophisch wuchs. Eine Anreicherung von 13C wurde bei im Licht gezüchteten Algen im Vergleich zur Dunkelheit beobachtet (Experiment 1 vs Experiment 3), wenn 13C-Bicarbonat verfügbar war (Abbildung 4)., Der berechnete Beitrag der photosynthetischen Kohlenstofffixierung betrug jedoch nur 1-10% des in Biomasse assimilierten Kohlenstoffs. Die höhere Effizienz des Stickstoffeinbaus von Beute, die im Licht relativ zur kontinuierlichen Dunkelheit beobachtet wurde (Abbildung 3; Experimente 1, 2 vs Experiment 3), legt nahe, dass Licht eine, wenn auch geringfügige Rolle bei der phagotrophen Effizienz der Alge spielte., Trotz mutmaßlicher Reduktionen der photosynthetischen Maschinerie von Ochromonas, die phagotroph auf HKB wachsen (wie niedrige Zellquoten von Chl a; Abbildung 1d), hatte Licht daher einen geringen und positiven Einfluss auf die Algenernährung. Da die Menge an Kohlenstoff, die durch die Photosynthese fixiert wurde, einen kleinen Anteil an Kohlenstoff darstellte, der von der Alge assimiliert wurde, wenn er auf HKB wuchs, spekulieren wir, dass der photosynthetische Apparat eher Energie als Kohlenstoff für zelluläres Material liefert, wie es für Ochromonas danica angenommen wurde (Wilken et al., 2014).,
Unsere Isotopenmassenbilanzberechnungen haben zwei Vorbehalte. Erstens haben wir die pH-Entwicklung innerhalb der Kulturen nicht kontrolliert, was bessere Einblicke in das Karbonatgleichgewicht gegeben hätte, das durch Atmung und Kohlenstofffixierung und den Austausch mit der Atmosphäre hätte beeinflusst werden können. Daher könnte unsere Schätzung, die auf den Experimenten mit markiertem anorganischem Kohlenstoff basiert, die durch Ochromonas sp festgelegte Menge an anorganischem Kohlenstoff unterschätzt haben. BG-1 (1% entsprechend der Isotopenmasse Balance)., In jedem Fall sollte das Experiment mit markiertem HKB nicht von dieser Einschränkung betroffen gewesen sein, und die Schätzung von 10% Kohlenstoff aus anorganischem Substrat ist wahrscheinlich realistisch. Zweitens wird Ochromonas aufgrund fehlender Kohlenstoffkonzentrationsmechanismen als ineffizienter Kohlenstofffixierer angesehen (Maberly et al. 2009), die die CO2-Konzentration durch den Transport von CO2 und/oder Bicarbonat zum RuBisCO-Enzym erhöhen (Raven et al., 2008). Andererseits hat die transkriptomische Analyse gezeigt, dass die photosynthetische Maschinerie des Stammes BG-1 funktionell ist (Lie et al.,, 2017), und unsere Experimente mit markiertem Bicarbonat zeigten eine signifikante Anreicherung der 13C fraktionierten Häufigkeit in Ochromonas (Abbildungen 4 und 5); daher Ochromonas sp. stamm BG-1 hat einige Fähigkeit, anorganischen Kohlenstoff zu verwenden, wenn auch ineffizient.
Dennoch dürfte die starke heterotrophe Aktivität von Ochromonas, während sie heterotroph wächst, den intrazellulären CO2-Pool sowie seinen Fluss erhöhen. Als Faustregel gilt, dass heterotrophe Protisten 40% der aufgenommenen organischen Substanz assimilieren, während sie 30% freisetzen und weitere 30% einatmen (Sleigh, 1989)., Auf dieser Grundlage könnte die Gesamtmenge an Kohlenstoff, die von Ochromonas als CO2 während des exponentiellen Wachstums freigesetzt wird, so hoch sein wie das zu Beginn der Inkubation hinzugefügte Gesamtbicarbonat, was Konsequenzen für das von uns vorgestellte Isotopenbilanz hat. Wenn wir davon ausgehen, dass das isotopisch angereicherte CO2, das aus der HKB-Atmung stammt, in den gleichen Mengen wie der gelöste anorganische Kohlenstoff verfügbar ist, zeigte die Inkubation, die mit Ochromonas und markiertem HKB durchgeführt wurde, dass ~84% Kohlenstoff aus dem HKB gewonnen wurden., Bis zu 20% des aus HKB gewonnenen assimilierten Kohlenstoffs könnten tatsächlich Kohlenstoff entsprechen, der zunächst durch Ochromonas respiriert und dann fixiert wurde. Wenn es richtig ist, würde die Atmung, die von der phagotrophen Aktivität abgeleitet ist, als Kohlenstoffkonzentrationsmechanismus für diese Ochromonas fungieren. Während die primäre Kohlenstoffquelle für Ochromonas, die geotrophisch wachsen, von HKB abgeleitet wurde, könnte eine nicht zu vernachlässigende Menge aus der Atmung und dann der CO2-Fixierung der bakteriellen Biomasse gewonnen worden sein.,
Ochromonas verlagerte seinen Stoffwechsel in Richtung Autotrophie, wenn es im Licht inkubiert wurde, aber erst nachdem es die HKB in den Kulturen aufgebraucht hatte (≈ 48 h Wachstum). Diese Verschiebung spiegelte sich in der Bulk-IRMS 13C-fraktionierten Häufigkeit für die Behandlung mit markiertem HKB wider, bei der eine Reduktion zwischen 48 h und 145 h beobachtet wurde (Experiment 2 in Abbildung 5), was auf den Einbau von nicht markiertem Kohlenstoff in Algenbiomasse über Lichtprozesse hindeutet. Chrysophyten gelten im Allgemeinen als schlechte autotrophe Kohlenstofffixierer aufgrund schlechter Kohlenstoffkonzentrationsmechanismen (Maberly et al., 2009)., Nichtsdestotrotz deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass es eine signifikante anorganische Kohlenstoffassimilation gab. Ein Vergleich der im Licht gewachsenen Kulturen (Experiment 1 in Abbildung 5) und der kontinuierlichen Dunkelheit (Experiment 3 in Abbildung 5) ergab, dass sich die 15N-Bruchfülle der dunklen Kulturen nach 95 h nicht änderte, während sich die Kulturen im Licht in 15N weiter anreicherten, was darauf hindeutet, dass Ochromonas weiterhin Stickstoff assimilierte, um seinen Stoffwechsel aufrechtzuerhalten, sobald HKB erschöpft war., Diese Ergebnisse stimmten mit der während dieses Zeitraums beobachteten Abnahme der Ammoniumkonzentration im Medium überein (Abbildung 3a), obwohl das anhaltende Auftreten von Phosphat im Medium während dieses Zeitraums ungeklärt ist.
Wir haben insgesamt eine gute Übereinstimmung zwischen den Massenisotopenmessungen und NanoSIMS-Messungen für Stickstoff erzielt, was mit Beobachtungen in früheren Studien übereinstimmt (Popa et al., 2007; Waisenkind und Haus, 2009; Kopf et al., 2015; Abbildung 4c)., Die Massenmessungen waren jedoch etwas niedriger in Bezug auf Bruchabflusswerte für Kohlenstoff, insbesondere für hochangereicherte Proben (Abbildung 4d). Wir spekulieren, dass die Unterschiede zwischen NanoSIMS und den Massenisotopenmessungen für Kohlenstoff mit der Tatsache zusammenhängen können, dass NanoSIMS-Proben mit Glutaraldehyd konserviert wurden, während die Proben für die Massenanalyse nicht. Es wurde gezeigt, dass die Fixierung zellulären Kohlenstoff beeinflusst (Musat et al., 2014), obwohl wir möglicherweise erwartet haben, dass dies den 13C in den NanoSIMS-Messungen relativ zu den Massenwerten verdünnt., Eine wahrscheinlichere Erklärung ist, dass die Einzelzellmessungen nicht durch Zelltrümmer in der Kultur beeinflusst werden, die möglicherweise weniger angereichert sind. Der Bulk-13C-Wert kann durch diese Komponenten relativ zu den NanoSIMS-Messungen verdünnt werden, was bedeutet, dass die NanoSIMS-Daten die Kohlenstoff-und Stickstoffaufnahme durch die Algen genauer widerspiegeln können. Die Variabilität von Zelle zu Zelle kann jedoch auch zu den geringfügigen Unterschieden zwischen den Massen-und NanoSIMS-Messungen beigetragen haben.,
Die Verwendung von NanoSIMS in dieser Studie stellt ihre erste Anwendung auf die Untersuchung von Kohlenstoff-und Nährstoffflüssen in einer mixotrophen Alge dar und hat ein besseres Verständnis der Kohlenstoff-und Energieaufnahme durch diese Spezies und des Zellstoffwechsels ermöglicht. Unsere Ergebnisse erweitern Informationen aus traditionellen Analysen von Ochromonas sp. stamm BG-1 gewachsen unter verschiedenen Bedingungen der Licht-und Beuteverfügbarkeit (Sanders et al., 2001), die bestätigt, dass der größte Teil des für das Wachstum verwendeten Stickstoffs und Kohlenstoffs durch seine bakterielle Beute gewonnen wird., Obwohl die Ergebnisse nicht direkt auf alle Arten entlang des Algenkontinuums mit unterschiedlichen mixotrophen Strategien extrapoliert werden können, validiert unsere Arbeit die Verwendung stabiler Isotopensondenexperimente und NanoSIMS, um die metabolischen Grundlagen der Mixotrophie bei einer Spezies besser zu verstehen. Darüber hinaus bietet es einen Ansatz zur Bewertung der heterotrophen Ernährung in Umweltproben. Ochromonas sp. stamm BG-1 lieferte ein ideales Modellsystem für den Vergleich der Massenisotopenanalyse mit NanoSIMS, da Bakterien innerhalb der ersten 48 h der Experimente schnell durch Weiden entfernt wurden., Die Übereinstimmung zwischen diesen beiden Messungen zeigt, dass NanoSIMS die Dynamik der Kohlenstoff-und Nährstoffaufnahme in diesem Mixotroph genau erfasst und daher breiter angewendet werden könnte, um Mixotrophie in komplexen gemischten Gemeinschaften zu untersuchen, in denen Massenmaßnahmen nicht ausreichen würden, um diese Dynamik zu erfassen. Diese und zukünftige detaillierte Studien werden weiterhin zu Verbesserungen in unserem Verständnis der Ernährung von mixotrophen Algen führen.